tartalom
Különböző típusú PCR
Polimeráz láncreakció (PCR) A standard PCR-eljárás enyhe módosításai alapján széles körben osztályozzák. A PCR különböző típusai a következők:
- Beágyazott PCR
- Inverz PCR
- Reverz transzkripciós PCR (RT-PCR)
- Aszimmetrikus PCR
- Kvantitatív PCR (Q-PCR)
- Kvantitatív valós idejű PCR (QRT-PCR vagy RTQ-PCR)
- Touchdown PCR
- Kolónia PCR
- Allél-specifikus PCR
- Polymerase Cycling Assembly (PCA) vagy Assembly PCR
- Lineáris utáni exponenciális PCR (KÉSŐI PCR)
- Dial-Out PCR
- Helikáz függő erősítés
- Hot Start PCR
- Szekvenciák közötti specifikus PCR
- Ligáció által közvetített PCR
- Metilezés-specifikus PCR
Beágyazott PCR
Ezt a technikát a véletlenszerű primer-kötődési amplifikáció miatt az amplifikált DNS-ben lévő szennyeződések csökkentésére javasolják. A beágyazott PCR-t két különböző primerkészlettel hajtják végre két egymást követő PCR-ciklusban. A következő halmaz várhatóan felerősíti a másodlagos célt az elsődleges futtatás termékén belül. Ez a technika rendkívül sikeres, bár sokkal több ismeretet igényel az érintett szekvenciákról.
Inverz PCR
Ezt akkor hajtják végre, ha a templát DNS egyetlen belső szekvenciája ismert. Ez a technika megfelelő a különböző géninszertek határoló szekvenciáinak azonosítására. A folyamat magában foglalja a templát-DNS emésztésének és önligálásának szekvenciáját, amelynek eredményeként ismert szekvenciájú DNS-darabok képződnek egy ismeretlen szekvencia végén.
Reverz transzkripciós PCR (RT-PCR)
RNS-könyvtárakból ismert szekvenciák amplifikálására és azonosítására használják. A mintából nyert RNS ezután komplementer DNS-vé (cDNS) alakul át reverz enzim transzkriptáz enzim hatására. A tipikus PCR-t ezután végezték el. Az RT-PCR-t széles körben használják azonosításban és a génexpresszió meghatározásában.
Aszimmetrikus PCR
Szelektíven amplifikálja a templát DNS egyik szálát, mint a másikat. A hibridizációs próbák során használják, ahol csak egy szál tekinthető ideálisnak. A további amplifikációt úgy érjük el, hogy standard PCR-t hajtunk végre a kiválasztott szálra feleslegben lévő primerek jelenlétében.
Kvantitatív PCR (Q-PCR)
Ez az RNS, cDNS vagy templát DNS kezdeti mennyiségének mérésének közvetett eljárása. A Q-PCR-t általában a PCR-termék mennyiségének gyors meghatározására használják. A Q-PCR-t a DNS-mintában lévő specifikus szekvenciák kimutatására is használják.
Kvantitatív valós idejű PCR (QRT-PCR vagy RTQ-PCR)
Ez az eljárás fluoreszcens festékeket használ az amplifikált termékek valós idejű mennyiségének monitorozására és mérésére. Ezt a kvantitatív valós idejű PCR-t a QPCR-rel konjugálva alkalmazzuk.
Touchdown PCR
Ez a technika csökkenti a nem specifikus primer kötődését azáltal, hogy csökkenti az összekapcsolási hőmérsékletet két egymást követő PCR ciklus között.
Kolónia PCR
A klónokat (pl. E. coli) elemezzük a megfelelő ligációs termékekre. Az adott telepet steril fogpiszkálón keresztül választják ki, és a mesterkeverékbe juttatják. A PCR-t meghosszabbított idővel, 95 °C-on működtetjükoC.
Allél-specifikus PCR
Ez a technika az egynukleotid polimorfizmuson (SNP) alapul, az allélspecifikus PCR-t gyakran használják klónozásra és diagnosztikai célokra. Némi előzetes tudás szükséges az allélok DNS-szekvenciájáról és azok különbségeiről. Az allélspecifikus PCR magában foglalja a 3'-véget tartalmazó SNP primerek használatát. A sikeres allél-specifikus PCR-amplifikáció és az SNP-specifikus primerek egy adott SNP jelenlétét jelzik a szekvenciában.
Polymerase Cycling Assembly (PCA) vagy Assembly PCR
Magában foglalja a hosszú DNS-szekvenciák mesterséges előállítását hosszú oligonukleotidok és rövid átfedő szegmensek jelenlétében a standard PCR eljárást követően. A hosszú oligonukleotidok mindkét irányba (szensz és antiszensz) megfordulnak, az átfedő szegmens határozza meg a PCR fragmentumok sorrendjét, elősegítve a végső hosszú DNS szelektív előállítását.
Lineáris utáni exponenciális PCR (KÉSŐI PCR)
Ennél a technikánál a limitáló primer (alacsonyabb mennyiségben jelenlévő primer) olvadáspontja magasabb, mint a feleslegben lévő primer (elegendő mennyiségben jelenlévő primer) a reakció hatékonyságának fenntartása érdekében, mivel a limitáló primer koncentrációja a reakció közepén csökken. .
Dial-Out PCR
Ez egy módszer a DNS-molekulák kinyerésére a génszintézishez. A DNS-könyvtárat specifikus határoló címkékkel módosítjuk a szekvenálás előtt. Később a címkével irányított primerek lehetővé teszik a kívánt szekvenciák DNS-ének kinyerését PCR-rel.
Helikáz függő erősítés
A hagyományos PCR-hez kapcsolódik, de állandó hőmérsékletet használ a ciklus helyett. A termikus denaturációs lépés helyett DNS-helikázt használnak.
Hot Start PCR
Ez a technika kizárja a nem specifikus amplifikáció lehetőségét a PCR kezdeti ciklusai során. A reakció komponenseit 95 °C denaturálási hőmérsékletre melegítjükoC-on a polimeráz hozzáadása előtt. Inhibitorokat és antitesteket viszünk be a reakcióelegybe gátlás céljából DNS-polimeráz aktivitás, amely magas hőmérsékleten disszociál.
Szekvenciák közötti specifikus PCR
A PCR-technikának ezt a módosítását gyakran használják DNS-ujjlenyomat-vételre, amely megköveteli az egyszerű szekvenciák ismétlődései közé helyezett régiók amplifikációját, hogy egyedi és specifikus ujjlenyomatot/mintát hozzon létre az amplifikált DNS-fragmensekből.
Ligáció által közvetített PCR
Kifejezetten a DNS kis linker molekuláit (inszertálandó) és különféle primereket használ, amelyek képesek kapcsolódni a linker DNS-hez. Ezt a technikát széles körben használják DNS-szekvenálásra és lábnyom-nyomtatásra.
Metilezés-specifikus PCR
Ezt a technikát a genomban lévő CpG-szigetek kimutatására használják. A metiláció-specifikus PCR során a DNS-t nátrium-hidrogén-szulfáttal kezelik, amely a metilálatlan citozin bázist uracillá alakítja, amelyet a PCR primer timin bázisai azonosítanak/felismernek. A megváltozott DNS-en két különböző PCR-készletet hajtunk végre, azonos primer-készletekkel, kivéve a primerek CpG-szigeteit. A primer készletek felismerik a citozin bázisokat, a többi primer készlet pedig az uracilt, hogy amplifikálja a nem metilált DNS-t. A Q-PCR is elvégezhető a metilációra vonatkozó mennyiségi információk megismeréséhez.
Koncepcionális MCQ-k különböző típusú PCR-ekhez (megoldva)
1. kérdés: Egy kutató öt egymást követő bázispárt próbál megváltoztatni a PCR-rel amplifikált DNS-fragmensek közepén. Melyik technika a leginkább ajánlott egy ilyen kísérlet elvégzéséhez?
A- DNS ligálás
B – Elektroforetikus mobilitás-eltolódási vizsgálat (EMSA)
C-PCR mutagenezis
D- Restrikciós enzim emésztés
Helyes válasz: C lehetőség PCR mutagenezis
Magyarázat:
Az ilyen típusú módosításokhoz leginkább ajánlott technika a PCR mutagenezis. Olyan primereket tud szintetizálni, amelyek tökéletlenül kötődnek a mutagenezis kívánt helyén. Ezek a primerek mostantól tartalmazzák az új, 5 bázispárból álló szekvenciát, amelyet az új DNS-szálba kell bevinni. Először is, a PCR amplifikálja a mutáns szekvenciát és az upstream szekvenciákat tartalmazó DNS-fragmenst. A PCR második ciklusa felerősíti a mutáns szekvenciát tartalmazó új DNS-szálat és a downstream szekvenciákat is. A PCR utolsó ciklusa pedig egy DNS-fragmenst amplifikál a két templátból, az eredeti primerek felhasználásával a teljes hosszúságú DNS-szál amplifikálására.
2. kérdés: A polimeráz láncreakció (PCR) hőstabil polimerázt (Taq polimeráz) használ a DNS-szál amplifikálására. Az állítások közül melyik írja le legjobban, hogy miért van szükség hőstabil polimerázokra a PCR-hez?
Az A-PCR-hez termikus ciklusra van szükség, és a Taq polimerázok inaktiválhatók, mivel az alacsony hőmérsékletű lépésekben nincs szükség rájuk.
B- A hőstabil (Taq) polimeráz nem töri fel a dsDNS-t, hacsak nem nagyon magas a hőmérséklet. Ezért hőstabil (Taq) polimerázra van szükség.
A C-PCR-nek termikus ciklusra van szüksége, és a hőstabil (Taq) polimerázok nem denaturálódnak, hogy elveszítsék hatékonyságukat a DNS polimerizációban magas hőmérsékleten (95oC) lépés.
D- A kétértékű kationok és a DNS-polimeráz közötti kölcsönhatás nagyon hatékony a magas hőmérsékletű lépések során. Így a PCR-hez hőstabil DNS-polimerázra van szükség.
E- A hőstabil (Taq) polimerázok olcsóbbak, mint a standard polimerázok; így alkalmasabbak a DNS amplifikálására.
Helyes válasz: C lehetőség
A PCR-hez hőciklusra van szükség, és a hőstabil (Taq) polimerázok nem denaturálódnak, hogy elveszítsék hatékonyságukat a DNS polimerizációban magas hőmérsékleten (95oC) lépés. Ez egyedülállóvá teszi a különböző típusú PCR-ek között.
Magyarázat:
A polimerázok gyakran magasabb hőmérsékleten denaturálódnak. Ha standard polimerázt használunk, akkor az magas hőmérsékletű (denaturációs) lépésben denaturálódik, ami a kétszálú DNS egyszálú DNS templátokká történő feltöréséhez szükséges. Ennek a hőstabil (Taq) polimeráznak a használatával a az enzim nem denaturálódik. A DNS-szálak a PCR kezdetén hozzáadott Taq polimeráz hatására tovább amplifikálódnak.
3. kérdés: Mi a PCR három lépésének helyes sorrendje?
A- Hosszabbítás, denaturálás, lágyítás
B- Denaturáció, lágyítás, extenzió
C- izzítás, nyújtás, denaturáció
D- Denaturáció, nyújtás, lágyítás
Helyes válasz: B lehetőség
Denaturálás, lágyítás, extenzió
Magyarázat:
A PCR lépései magukban foglalják a denaturációt, az annealingot és az extenziót.
A denaturálást 94-98 °C körüli hőmérsékleten végezzük a kettős szálú DNS hidrogénkötéseinek megszakításához.
A lágyítás a PCR második lépése, amely 50-65 °C-on fejeződik be. Az összekapcsolási lépést alacsony hőmérsékleten kell végrehajtani ahhoz, hogy a primerek az egyszálhoz kapcsolódjanak, de elég magas hőmérsékleten a nem specifikus hibridizáció elkerüléséhez.
A PCR kiterjesztési vagy elongációs lépése lehetővé teszi a DNS-polimeráz számára, hogy szintetizálja a templát DNS-szál legújabb másolatát. Az optimális hőmérséklet a használt DNS-polimeráztól függ, de általában 75-80°C.
4. kérdés: Az alábbiak közül melyik összetevő/nem része egy polimeráz láncreakció keveréknek?
A- Pufferoldat
B-DNS polimeráz
C- formamid
D-DNS templát szál
Helyes válasz: C lehetőség
Formamid
Magyarázat:
A PCR összetevői a DNS (Taq) polimeráz, puffer, primerek, magnézium-klorid, dNTP-k (adenin, guanin, citozin, timin), dezoxinukleotid-trifoszfátok és a DNS templát szál.
Következtetések
Ebben a cikkben a PCR különböző típusait tárgyaltuk. A témával kapcsolatos további információkért látogassa meg különböző típusú PCR.
További témákért bioszintézis és a biotechnológia meglátogathatja oldalainkat.
